液相色譜儀的選擇和使用

 

    一、液相色譜儀的選擇

 

    1、柱子的PH值使用范圍

 

    反相柱優(yōu)點(diǎn)是固定相穩定，應用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時(shí)一定要注意流動(dòng)相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動(dòng)相的PH值小于2時(shí)，會(huì )導致鍵合相的水解；當PH值大于7時(shí)硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會(huì )塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。

 

    2、填料的端基封尾（或稱(chēng)封口）

 

    把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩定性好了，組分的保留時(shí)間重現性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。

 

    二、液相色譜儀的使用

 

    色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測試，并將結果保存起來(lái)，作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測試時(shí)要按照色譜柱出廠(chǎng)報告中的條件進(jìn)行（出廠(chǎng)測試所使用的條件是條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。

 

    1、樣品的前處理

 

    a、使用流動(dòng)相溶解樣品。

 

    b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不  可逆吸附的雜質(zhì)。

 

    c、使用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。

 

    2、流動(dòng)相的配制

 

    液相色譜儀是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

 

    a、流動(dòng)相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì )沉淀在柱中（或長(cháng)時(shí)間保留在柱中）。

 

    b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應

 

    c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長(cháng)泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。

 

    d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

 

    e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實(shí)驗無(wú)法進(jìn)行。

 

    f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

 

    3、流動(dòng)相流速的選擇

 

    因柱效是柱中流動(dòng)相線(xiàn)性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求柱效，使用流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

 

    當選用流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(cháng)。液相色譜儀可采用改變流動(dòng)相的洗滌強度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。

 

    注意：

 

    a.含水流動(dòng)相在實(shí)驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。加入，防止細菌生長(cháng)。

 

    b.流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。

 

    c.使用HPLC級溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(cháng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

 

    三、液相色譜儀的維護

 

    1、色譜柱的平衡

 

    反相色譜柱由工廠(chǎng)測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。 每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來(lái)平衡色譜柱，您就會(huì )在處理問(wèn)題方面獲得的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會(huì )變得更長(cháng)！操作步驟：

 

    a、平衡開(kāi)始時(shí)將流速緩慢地提高，用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線(xiàn)（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長(cháng)的時(shí)間來(lái)平衡）

 

    b、如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過(guò)渡"即每天分析開(kāi)始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡； 分析結束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。

 

    2、色譜柱的再生

 

    長(cháng)期使用的色譜柱，往往柱效會(huì )下降（柱子的理論塔板數減低）。液相色譜儀可以對色譜柱進(jìn)行再生，在有條件的實(shí)驗室應使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生。